Estudo e avaliação da carcinogênese

A carcinogênese é estudada com vários testes toxicológicos padronizados. Uma primeira parte destes testes é realizada in vitro e - se forem positivos - procedemos a uma experimentação in vivo. Esta abordagem experimental passo a passo é chamada de ABORDAGEM DO PONTO DE DECISÃO, uma sequência de tentativas que termina no final de cada tentativa para decidir como prosseguir com a tentativa. Existem cinco estágios:

FASE A: estrutura e características do composto cancerígeno;

FASEB: nesta fase de testes in vitro de curta duração, são utilizadas células de mamíferos. As células mais utilizadas são os hepatócitos, pois se estuda a extensão do reparo ao dano que o hepatócito desenvolve de acordo com a gravidade do dano causado pela substância. Em suma, não determinamos o dano em si, mas quanto do sistema de reparo foi ativado pela célula do fígado.

O procedimento implementado é a formação de 3 culturas de hepatócitos. Na primeira cultura os hepatócitos são saudáveis, na segunda são tratados com a substância teste e, finalmente, na terceira são tratados com uma substância de controle certamente cancerígena.Essas três culturas contêm uma base pirimidina radioativa, que é a timidina tritiada, que atua como um marcador.

Se o composto sob exame causa uma mutação no DNA, a célula responde a esse problema ativando os sistemas de reparo. O pedaço de DNA que sofreu a mutação é cortado e graças à ação da DNA polimerase a parte que faltava é substituída por uma nova. Para a correção, a DNA polimerase usa as novas bases, incluindo a timidina tritiada. Uma base radioativa é incorporada. A análise da radioatividade determina o nível de mutação nas células tratadas: quanto maior a radioatividade, maiores as mutações no DNA.

Também na fase B são realizados testes em bactérias, para poder estudar se existem mutações reversas. As bactérias utilizadas são salmonelas já portadoras de mutações. A mutação diz respeito à síntese de histidina, de modo que as salmonelas são incapazes de crescer sem histidina. Essas colônias bacterianas são parcialmente tratadas com a substância de teste, parcialmente para o controle negativo e parcialmente para o controle positivo, e então testadas com um carcinógeno conhecido. Se a substância em estudo for um genotóxico indireto, as enzimas de metabolização devem ser introduzidas no meio de cultura. Neste ponto existem 3 culturas que serão semeadas e cultivadas em placas de Petri (não há histidina no meio de cultura). Se não houve nenhuma mutação pelo carcinógeno a ser testado, em teoria não deveria haver nenhuma nas placas . Se houve uma ação mutagênica do carcinógeno, pode ter alterado a primeira mutação e criado uma segunda mutação capaz de fazer crescer a bactéria no meio de cultura sem histidina. Neste caso, a segunda mutação que modifica a primeira mutação e leva o nome de RETROMUTAÇÃO Finalmente, se ocorrer um crescimento significativo na piasta petri, o carcinógeno é direto.
Sempre com um teste in vitro é possível determinar a integridade cromossômica Este teste é sempre realizado em células de mamíferos e é utilizado para testar substâncias tóxicas capazes de causar mutações em algumas enzimas responsáveis pela biossíntese do DNA. é submetido a análise in vitro. Para ser capaz de determinar se a substância em exame afeta a integridade e o número de cromossomos presentes, o teste do micronúcleo é usado. Os micronúcleos são vesículas formadas com uma parte da cromatina em seu interior. A cromatina incorporada nesses micronúcleos pode ser cromossomos inteiros ou fragmentos de cromossomos. Os micronúcleos são formados pela divisão celular errada dando origem a células-filhas com material genético não igualmente O resultado deste teste será a determinação de substâncias que são definidas como venenos clastogênicos e do fuso. A substância clastogênica produz micronúcleos com fragmentos acêntricos de cromossomos, de modo que a substância induz uma quebra nos cromossomos, em vez da substância venenosa do fuso produz os micronúcleos que dentro dela estão presentes cromossomos inteiros.
Se a substância em exame induzir genotoxicidade em um ou mais testes, isso é definido como altamente suspeito, então vai direto para a fase D. Se, por outro lado, a substância testada não produz nenhum efeito genotóxico, passa para a fase de estudo C porque pode ser um promotor.

FASEC: nesta fase podem ser realizados testes in vitro e in vivo.

Em testes in vitro, pode-se demonstrar a possibilidade da substância promotora romper as junções comunicantes entre as células normais e as células tumorais, com consequente passagem de substâncias entre as duas células.

Um teste in vivo é a indução de tumores de pele em camundongos. A substância a ser testada é aplicada duas ou três vezes por semana na pele do camundongo. Em 2/3 meses, se esta substância for um promotor, pode haver formações de papiloma. Em camundongos, dois dados principais são considerados: o número de camundongos afetados por papilomas e o número de papilomas presentes em cada animal. Se a substância atua como um promotor e desenvolve um tumor no camundongo tratado, significa que é de fato uma substância com um efeito promotor.

Assim que esses testes forem concluídos, passamos para os testes in vivo de longo prazo.

FASED: nesta fase são testados todos os compostos que se revelem mutagénicos e todos os compostos que não se provem mutagénicos. Os testes que podem ser realizados são diferentes, alguns dos quais são testes feitos no fígado, no pulmão e, finalmente, na mama.

O exame de fígado demonstra a formação não de um tumor neoformado, mas de um foco neoplásico, portanto algo que se prepara para virar tumor. As células desse foco já são células atípicas, portanto, sofreram uma mutação e estão se preparando para se tornar células neoplásicas. Depois de um certo tempo, graças ao exame de autópsia, determina-se a formação dos focos pré-neoplásicos, calculando-se o número e a extensão dessas formações pré-neoplásicas.

O teste do pulmão permite a determinação de um adenoma, que é uma "anomalia das células do tecido pulmonar. Também neste caso, o tecido pulmonar do rato é examinado após um tempo bastante longo (meses) (esses adenomas são facilmente identificáveis porque são nódulos esbranquiçados no epitélio pulmonar).
O teste de mama permite a determinação de tumores no tecido glandular. O número de adenomas formados e o número de animais apresentando adenomas são sempre avaliados.

Se houver resultados positivos nesses testes, a substância em teste é realmente cancerígena. Neste ponto, passamos a conduzir testes caros com tempos de execução muito longos.

PHASEE: nesta fase, um número variável de animais, de 20 a 50, são submetidos a testes de longa duração, que são muito caros e demoram a se obter alguns resultados; falamos de cerca de 1/8 da vida do animal, é possível que durante o processo desses testes alguns animais morram, mas são sempre estudados com uma autópsia e exame do tipo histológico. Os animais escolhidos são sempre ratos e camundongos e apenas 70-80% sobrevivem até o final dos testes de longo prazo. Os animais utilizados acabam de ser desmamados, quanto mais jovens, mais sensíveis aos tratamentos. Durante o período de teste de longa duração, o pesquisador é sempre apoiado por um matemático-estatístico, capaz de levar em conta todas as informações coletadas e reproduzir os diversos dados.

As doses testadas em animais partem da dose máxima tolerada e todos os seus submúltiplos, e a reação dose-resposta no animal é avaliada.
A administração deve sempre abordar a via pela qual o homem pode entrar em contato com a substância em exame, portanto, a via oral, cutânea ou respiratória, ao passo que se for testada a carcinogenicidade de um medicamento também é útil a administração intravenosa.
Os grupos de animais testados são 4 (50 animais para cada grupo):

Um grupo NAIF que não tem tratamento;
Um grupo tratado com o veículo;
Um grupo tratado com a substância de teste;
Grupo tratado com um agente cancerígeno conhecido.

É muito importante que o número de animais em cada grupo seja o mais igual possível.Na verdade, se houver muita diferença no número de animais, o teste estatístico pode acabar falhando.
As avaliações realizadas são:

Frequência total de tumores;
Frequência de alguns tumores;
Frequência de animais com mais de um tipo de tumor;
Número de cânceres em animais.

Ao final de todas essas fases do estudo, a substância é classificada em um ranking estabelecido pela IARC (Agência Internacional de Pesquisa e Desenvolvimento sobre o Câncer) e pela Agência de Proteção Ambiental (EPA).